LÍNEAS CELULARES HOSPEDADORAS Y MÉTODOS PARA IDENTIFICAR Y USAR DICHAS LÍNEAS CELULARES HOSPEDADORAS

Solicitante

Inventores (6)

Clasificación Internacional de Patentes (IPC)

Resumen técnico

Se describen líneas celulares hospedadoras y líneas celulares productoras derivadas de líneas celulares parentales HeLaS3 y métodos para producir las líneas celulares hospedadoras y las líneas celulares productoras. Reivindicación 1: Una célula hospedadora derivada de una línea celular parental HeLaS3. Reivindicación 7: Un método para seleccionar una línea celular hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6: (a) expandir una o más poblaciones de la línea celular parental HeLaS3 en un medio libre de suero; (b) seleccionar y aislar uno o más clones celulares individuales de la etapa (a); (c) expandir cada uno de los uno o más clones celulares individuales de la etapa (b) en un medio libre de suero; (d) seleccionar de cada uno de los uno o más clones celulares individuales de la etapa (c) y analizar los uno o más clones celulares individuales para al menos una de las siguientes características: (i) tiempo de duplicación celular, (ii) eficiencia de transfección, (iii) densidad máxima de células viables; (iv) crecimiento celular después de la siembra a baja densidad celular; y (iv) cualquier combinación de los mismos; y (e) cultivar uno o más clones celulares individuales seleccionados de la etapa (d) en un medio libre de suero; resultando así en la línea celular hospedadora. Reivindicación 19: Una partícula de AAV recombinante (rAAV) producida mediante un método que comprende: a) transfectar la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 o una línea celular hospedadora seleccionada usando el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 18 en condiciones para generar las partículas de rAAV, donde la línea celular hospedadora se transfecta con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un transgén heterólogo flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR), una rep de AAV, una cap de AAV y opcionalmente un marcador seleccionable; y expandir la una o más población(es) de la línea celular parental transfectada; b) infectar la una o más poblaciones con un virus auxiliar AAV o un derivado del mismo; y c) recolectar las partículas de rAAV. Reivindicación 27: Un método para generar una línea celular productora candidata para la producción de partículas de AAV recombinante (rAAV), el método comprende: (a) transfectar de forma estable la línea celular hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 en medio libre de suero o una línea celular hospedadora que se ha seleccionado mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 7 - 18 en un medio libre de suero con uno o más ácidos nucleicos que codifican (i) un transgén heterólogo flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas de AAV, (ii) un gen rep de AAV y un gen cap de AAV para generar una línea celular productora, y (b) infectar la línea celular productora con un virus auxiliar de AAV para producir partículas de rAAV; y seleccionar la línea celular productora como candidata para la producción de partículas de rAAV si la línea celular productora genera un título de partículas de rAAV de al menos aproximadamente 1E9 vg/mL. Reivindicación 43: Un método para producir una línea celular hospedadora que comprende las etapas de: (a) expandir una o más poblaciones de una línea celular parental HeLaS3 a una densidad de 0.5 células/pocillo en medios que comprenden medio de crecimiento EX-CELL HeLa complementado con L-Glutamina 6 mM, DMEM/F-12 al 50% (complementado con L- Glutamina 6 mM), 20% de medios acondicionados y 1x suplemento de InstiGRO CHO, en donde todos los componentes de los medios y medios acondicionados están libres de suero y libres de componentes derivados de animales; (b) seleccionar y aislar uno o más clones celulares individuales de la etapa (a); (c) expandir cada uno de los uno o más clones celulares individuales de la etapa (b) en un medio libre de suero; (d) seleccionar de cada uno de los uno o más clones celulares individuales de la etapa (c) para al menos una de las siguientes características: (i) una viabilidad celular, (ii) un tiempo de duplicación celular, (iii) una eficiencia de transfección, (iv) una densidad celular viable máxima; (v) aglomeración; (vi) crecimiento celular después de la siembra a baja densidad celular; y (vii) cualquier combinación de los mismos y (e) aislar y expandir una sola célula seleccionada de la etapa (d) en un medio libre de suero, produciendo así la línea celular hospedadora. Reivindicación 44: Un método para generar una línea celular productora que comprende las etapas de (a) transfectar la línea celular hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 o una línea celular hospedadora que se ha seleccionado mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 o 43 con uno o más ácidos nucleicos que codifican (i) un transgén heterólogo flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas de AAV, (ii) un gen rep de AAV y un gen cap de AAV, (iii) y genes auxiliares de AAV; y (b) seleccionar la línea celular productora donde la línea celular productora genera un título de partículas de rAAV de al menos aproximadamente 1E9 a aproximadamente 1E11 vg/mL. Reivindicación 45: Un método para elaborar virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que comprende las etapas de: (a) transfectar la línea celular hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 o una línea celular hospedadora producida mediante el método de las reivindicaciones 7 o 43 con uno o más ácidos nucleicos que codifican (i) un transgén heterólogo, (ii) un gen rep de AAV y un gen cap de AAV, y (iii) repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV; (b) infectar la célula hospedadora con un virus auxiliar; y (b) aislar las partículas de rAAV en donde el título de las partículas de rAAV producidas es al menos aproximadamente 1E9 vg/mL.